CNBr活化磁性瓊脂糖色譜填料是一種磁性瓊脂糖樹脂，可以用于制造各種磁性親和色譜色譜填料，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。

CNBr活化磁性瓊脂糖色譜填料在制備和使用定制親和色譜填料方面具有良好的記錄。將生物特異性配體與CNBr 活化的瓊脂糖偶聯(lián)是一種廣泛使用、成功且有據(jù)可查的技術(shù)。偶聯(lián)反應(yīng)是自發(fā)的、快速的并且易于進(jìn)行。不需要有毒化學(xué)品或特殊設(shè)備。

應(yīng)用領(lǐng)域包括蛋白質(zhì)、多肽和核酸的固定化。

1. 屬性

CNBr活化磁性瓊脂糖色譜填料(4 HF)由高度交聯(lián)的4%磁性瓊脂糖制成。它可以在更嚴(yán)苛的條件下操作使用，因此可以應(yīng)用低pH值和某些高濃度有機(jī)溶劑。

由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性，長(zhǎng)期以來(lái)一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對(duì)大蛋白質(zhì)分子具有出色的傳質(zhì)性能。

基礎(chǔ)基質(zhì)與溴化氫（CNBr）反應(yīng)生成活性基團(tuán)，這些活性基團(tuán)與待固定分子中的伯胺基團(tuán)反應(yīng)。CNBr活化磁性瓊脂糖色譜填料以含有添加劑的凍干粉形式提供。

表1  CNBr活化磁性瓊脂糖層析介(4HF)的特性

2. 配體固定化

2.1 培養(yǎng)基的預(yù)處理

CNBr活化磁性瓊脂糖色譜填料以含有添加劑的凍干粉末形式提供。這些添加劑必須在偶聯(lián)反應(yīng)前洗掉。使用足夠量的低 pH 洗滌液以保持反應(yīng)基團(tuán)的活性。

2.1.1 稱取所需的粉末（1 g干粉提供約3 ? 5 ml固定體積的色譜填料）并將其懸浮在預(yù)冷的 1 mM  HCl中（1 g 干粉使用10  mL 1 mM  HCl）。讓色譜填料在低溫下膨脹30分鐘。

2.1.2  在重力流或受控慢流下，在過(guò)濾裝置中用冷的1  mM  HCl 清洗凝膠。所需酸的總體積為15到 20 個(gè)凝膠體積。洗滌后的色譜填料應(yīng)立即用于以下偶聯(lián)步驟。

2.2配體偶合

以下是一般的配體偶聯(lián)程序。

2.2.1  將目標(biāo)配體溶解在含有0.5 M NaCl的0.1 M NaHCO₃，pH 8.3的偶聯(lián)緩沖液中。對(duì)于蛋白質(zhì)配體，凝膠濃度為5-20 mg/ml。對(duì)于小配體，凝膠濃度為1-10 µmol/ml 。偶聯(lián)緩沖液的體積應(yīng)與固定凝膠的體積相同。

2.2.2  將洗凈并吸干的凝膠（來(lái)自步驟  2.1.2）轉(zhuǎn)移到上述溶液中。

2.2.3 漿液在4℃下混合過(guò)夜或在室溫下混合3-4小時(shí)。

2.2.4  用至少5 倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液清洗凝膠。

2.2.5 將凝膠重新懸浮到相同體積的封閉溶液中，0.1 M Tris/HCl，pH  8.0 或1  M乙醇胺 pH  8.0，持續(xù)2 - 3小時(shí)。

2.8 用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M醋酸鹽緩沖液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠。

2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。

3. 固定化效率的一般考慮

3.1 pH

pH 8.3的緩沖液常用于蛋白質(zhì)固定。然而偶聯(lián)pH值可在6-10之間進(jìn)行優(yōu)化以獲得最佳結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。

注意：配體溶解后要調(diào)節(jié)偶聯(lián)pH值。

3.2 偶聯(lián)方案

應(yīng)避免使用含有氨基的溶液。

可以引入稀釋的某些有機(jī)溶劑以提高配體的溶解度。應(yīng)事先測(cè)試此類溶劑的適用性。

3.3 鹽

偶聯(lián)緩沖液加入鹽可以提高固定效率。

3.4 基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化基團(tuán)

對(duì)于某些配體或應(yīng)用，基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化水平可能過(guò)高，偶聯(lián)配體的活性可能會(huì)降低。

在降低的pH值下偶聯(lián)可能會(huì)減少配體分子的連接點(diǎn)。它可以提高偶聯(lián)配體的活性。活化基團(tuán)的受控水解，例如在添加配體前幾個(gè)小時(shí)用偶聯(lián)緩沖液孵育凝膠，也可以減少過(guò)度偶聯(lián)問題。

3.5 屏蔽剩余的活化配體

未與配體反應(yīng)的活化基團(tuán)應(yīng)通過(guò)添加額外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如Tris或乙醇胺）來(lái)封端。

3.6 最終色譜填料的洗滌

偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。

4. 固定化親和色譜填料的使用

配體偶聯(lián)色譜填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。

5. 儲(chǔ)存

凍干的CNBr活化磁性瓊脂糖色譜填料應(yīng)在8℃下儲(chǔ)存。偶聯(lián)的濕色譜填料應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲(chǔ)存。切勿凍存耦合色譜填料。

6. 更多信息

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